Analizando canales únicos

La conducta de un canal unitario dependiente de voltaje: 

Para estudiar canales únicos, debemos tener una parte de la membrana aislada en la pipeta, proceso que se realiza por medio de la técnica del pinzamiento zonal de membrana o patch clamp (Figura 1). Esta técnica permite registrar corrientes iónicas unitarias a través de zonas minúsculas de membranas celulares.

Figura 1: Técnica de Patch Clamp. Se muestra cada una de sus configuraciones, on cell o cell attached, whole cell, inside out y outside out.

Los registros de canal unitario son de naturaleza aleatoria. La apertura del canal se refleja en aumentos o disminuciones repentinas en intensidad de corriente registrada, según el sentido de la corriente iónica. Los pulsos que aparecen en un registro de canal unitario son cuadrados y corresponden a las transiciones finitas entre los estados cerrado (no conductor) y abierto (conductor) del canal (Figura 2). 

Figura 2: Registro de canal único. El eje X corresponde al tiempo y el eje Y a la corriente.

El análisis de los fenómenos unitarios es de naturaleza estadística. La altura del pulso corresponde a la intensidad de corriente que atraviesa un único canal, de este modo, si en el registro hay dos canales activos, observaremos una mezcla de pulsos de intensidad unitaria y doble que corresponderá a la apertura simultánea de los dos canales.  

En la figura 3, podemos ver el comportamiento de un mismo canal cuando se aplica varias veces el mismo pulso de prueba, el que parte de -100 mV, potencial en el que suponemos, nuestro canal estará en estado cerrado para luego despolarizar la membrana con un salto de voltaje que llegue a los +50 mV, potencial en el que el hipotético canal debería abrirse. Además, suponemos que este canal presenta sólo dos estados, uno cerrado y otro abierto. De este tipo de registros, es posible determinar la probabilidad de apertura, o sea, la probabilidad de encontrar el canal abierto a un determinado potencial, esto lo podemos conseguir simplemente dividiendo el tiempo que el canal está abierto por el tiempo total. Además, si promediamos todos los registros del canal único realizados a diferentes tiempos, con un mismo pulso de voltaje, podemos obtener un registro similar al obtenido en una corriente macroscópica. Es interesante ver que a pesar que se trata del mismo canal analizado varias veces con el mismo pulso de voltaje, todos los registros son diferentes, lo que como ya se ha mencionado, es consecuencia de que el fenómeno de apertura y cierre son aleatorios.

Figura 3: Gating de canal único de potasio. Registros patch clamp de corrientes de canal único de potasio en el axón gigante de calamar durante pasos de voltaje desde -100 mV a +50mV. A, nueve ensayos consecutivos muestran una conductancia de 20 pS. B. promedio de 40 repeticiones de mediciones de canal único como las mostradas en A. (LLano et al. 1988).

Cálculo de la conductancia unitaria: Histograma de distribución de estados.

La medida de la corriente iónica que fluye por un canal se puede calcular fácilmente a partir de un registro de canal unitario, para esto, simplemente debemos medir la diferencia de amplitud entre el estado cerrado (línea base) y el estado abierto. Conociendo los detalles de como se realizó y adquirió digitalmente el registro, se puede calcular de manera muy simple la equivalencia entre unidades de medida (mm o cm) y unidades de corriente unitaria (pA, pico-amperios). Es necesario que tengas presente que para obtener un valor preciso de la corriente unitaria que fluye a través del canal a un determinado voltaje, este procedimiento deberá ser realizado en una población estadisticamente significativa de aperturas y cierres. Conociendo la corriente unitaria (i) y el voltaje impuesto (V), la conductancia unitaria, g, podrá ser fácilmente calculada basándonos en la ley de Ohm:

Ahora, si lo que buscas es un valor mucho más preciso de la conductancia, entonces deberás analizar la curva i-V (para canal unitario), pues la pendiente de la misma corresponde al valor de la conductancia.

El método descrito anteriormente, sirve para un caso ideal en que los estados cerrado y abierto están claramente definidos y el nivel de ruido es relativamente bajo. La realidad, sin embargo, nos muestra muchas veces que el ruido es un factor importante ya que puede enmascarar el verdadero estado abierto.También es probable que en nuestro registro contemos con más de un canal, lo que también puede llevar a confusión. Un método alternativo para obtener la conductancia del canal, es construir un histograma de amplitudes o histograma de distribución de estados. La forma de hacerlo es muy sencilla: se mide la intensidad de corriente de cada punto del registro de canal unitario y se agrupan las medidas en intervalos de amplitud determinada (por ejemplo 0.08 pA). Realizada la agrupación, se grafica el histograma de frecuencias (corriente iónica (eje X) vs. número de casos (eje Y)). Observarás que aparece una distribución en forma de campana (o distribución gaussiana) con uno o más picos: Si el registro tiene dos estados, el histograma mostrará dos picos claramente definidos, donde uno corresponderá a los estados cerrados y el otro a los estados abiertos. Conseguido el histograma de amplitudes, los valores experimentales pueden ajustarse a distribuciones de Gauss para determinar los parámetros que las caracterizan.

Figura 4: Análisis de registros de canal único: A. corriente de salida. B, histograma de distribución de estados. El eje X está en función de la corriente, mientras que el eje Y es el número de eventos. Se ven dos picos, donde el de la izquierda corresponde a los estados cerrados mientras que el de la derecha corresponde al estado abierto. En líneas punteadas se puede ver el ajuste gaussiano. Ya que el registro se basa en la actividad de sólo un canal, se puede medir la probabilidad de apertura, midiendo el área bajo la curva. En C, se puede ver el mismo histograma de B, pero en función logarítmica.

De los histogramas puedes obtener dos valores importantes:

• Si trazas una línea recta desde el pico de cada campana hasta el eje X (corriente), obtendrás dos valores diferentes para cada gaussiana, es decir, un valor de corriente para los canales cerrados, que será cero o estará cerca de cero y otro para la corriente de los estados abiertos. De este modo, si restamos los valores máximos obtenidos para los canales abiertos y cerrados, obtendremos el valor de la corriente promedio para los canales abiertos. 
• Además, la razón del área bajo la curva de las dos campanas nos entregarán la probabilidad de apertura del canal. Claramente, cuanto mayor sea el área de una distribución mayor será el tiempo de residencia del canal en ese estado particular y mayor será la probabilidad de encontrarle en ese estado. Por tanto, la probabilidad de canal abierto se puede calcular fácilmente mediante:

Donde A_x representa el área bajo la curva de Gauss del estado x (cerrado o abierto). La probabilidad del estado cerrado puede calcularse fácilmente siguiendo la misma estrategia.

Histogramas de tiempo de residencia de los estados cerrado y abierto.     Para obtener un histograma de los tiempos de residencia (o dwell time) del canal en uno u otro estado, lo primero que hay que hacer es construir una tabla de eventos, la que nos permitirá extraer información sobre el comportamiento aleatorio de las transiciones de apertura-cierre. Para esto, debes

1.    Identificar los estados en el registro de canal unitario.

2.    Medir la duración temporal de cada una de las transiciones o eventos.

3.    Separar las medidas del estado cerrado y abierto en tablas.

Obtendremos así dos tablas, una para el estado cerrado y otra para el estado abierto, en la que estarán los tiempos que el canal ha residido en cada uno de ellos.

La forma de construir estos histogramas es similar a la descrita para el de amplitudes. Los eventos temporales se agruparán en intervalos de una determinada amplitud (0.1 ms ó 0.3 ms ó etc). Entonces se representará la frecuencia de los distintos intervalos de tiempo en función de los tiempos de apertura o cierre, creándose así los histogramas. Estos histogramas, a diferencia de los de amplitudes, son descritos por funciones exponenciales del tipo:

donde a y b son constantes y representan las áreas de los respectivos componentes exponenciales, t ₁ y t ₂ son las constantes de tiempo. 

El número de exponenciales que definen el histograma estará relacionado con el número de componentes que caracterizan a un estado en particular (Figura 5). Por ejemplo, si la cinética del estado cerrado se describe bien con dos exponenciales nos estaría indicando que el canal tiene que pasar por, al menos, dos estados cerrados antes de alcanzar el estado abierto. De este modo, este tipo de análisis puede utilizarse para sacar información valiosa sobre el mecanismo de apertura-cierre.

Figura 5: Histograma de tiempos de residencia o dwell time: como se puede ver en este ejemplo, para el caso de los eventos cerrados (histograma de la izquierda) se pueden realizar tres ajustes exponciales de los eventos, lo que da un indicio de que el canal presentaría por lo menos tres estados cerrados. Por otro lado, en el caso de los eventos en estado abierto, el histograma ajusta a sólo a una exponencial, por lo tanto es probable que el canal sólo presente un estado abierto. Como vemos, en el eje X tenemos el tiempo que duran los eventos mientras que en el eje Y tenemos el número de eventos.