Vídeo y protocolos de Patch Clamp de canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus laevis

En entradas anteriores hemos descrito la técnica del patch clamp y sus diferentes configuraciones (ver La técnica del Patch Clamp). Hoy, buscando en pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov) encontré un vídeo muy ilustrativo de la técnica del Patch Clamp en ovocitos de Xenopus laevis. Además, se anexan dos protocolos, uno para remover la vitelina del ovocito y otra para la generación del gigasello. 

El vídeo y los protocolos están en inglés y además para poder verlos completos, deberás registrarte. 

Recomiendo que se registren, sólo les tomará un minuto, es gratis y la calidad del vídeo y de la información es muy buena. Lo único es que la suscripción dura un día solamente. Espero que lo disfruten.

JoVE: Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes (Video Protocol)

Vídeo y Protocolos para hacer microelectrodos para Patch Clamp

Una herramienta muy importante a la hora de obtener buenos giga sellos, son las pipetas o también conocidos como microelectrodos de vidrio. Hoy en día, cada pipeta se fabrica de capilares de vidrio usando un puller que se programa a gusto del experimentador.

Adjunto este vídeo, donde se muestra cómo hacer pipetas tanto para registros intracelulares como para patch clamp. Igual que para ver el vídeo de Patch Clamp deberás registrarte, sin embargo, es todo gratuito, aunque la duración de la suscripción es limitada y sólo durará un día. 

Si te interesa la electrofisiología, o necesitas aprender patch clamp recomiendo que te registres, es un vídeo bien ilustrativo y práctico de la Universidad de Stranford.

JoVE: Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller (Video Protocol)

outside out e inside out

Ambos son parches escindidos de la célula.

Esta técnica provee al investigador un control total del ambiente del parche y de los canales iónicos que se encuentran en éste, tanto eléctrica como químicamente.

Outside out, se refiere a que la cara externa de la membrana celular queda orientada hacia el baño, mientras que por el contrario, la configuración inside out utiliza la cara intracelular orientada hacia el baño.

• La configuración outside out es obtenida simplemente tirando la pipeta de la membrana celular, una vez obtenida la configuración whole cell. De este modo, la membrana se rompe y según las propiedades de los fosfolípidos, estos se vuelven a juntar formando nuevamente un parche en la pipeta. Ahora entonces, la solución iónica contenida en la pipeta será como el interior de la célula. Los parches outside out pueden ser utilizados para estudiar el efecto de factores extracelulares en el canal, ya que la composición del baño puede ser fácilmente alterada durante el registro.

• La configuración inside out es obtenida desde la configuración cell attached. Una vez en esta configuración, a través de un suave tirón la pipeta es separada de la membrana formándose una vésicula alrededor de la boca de la pipeta. La vesícula puede ser rota al sacar la pipeta del baño y exponer la vesícula al aire. Esto produce un parche donde la cara interna de la membrana celular queda expuesta hacia el exterior (baño) y la cara externa queda expuesta al interior de la pipeta. Los parches inside out son ideales para estudiar el efecto de factores citosólicos en los canales.

Figura 1: configuraciones de parche escindido, outside out e inside out.

Whole cell

Para llevar a cabo esta técnica es necesario lograr primero la configuración cell attached. Una vez conseguido el gigasello (resistencia del orden del giga ohm), es necesario romper la membrana que está por debajo del orificio de la pipeta provocando con esto, el contacto eléctrico directo con el citoplasma, de tal modo, que la solución de registro ubicada en el interior de la pipeta queda en contacto con el medio interno de la célula.  Un método común para romper la membrana es aplicarle una pequeña succión al parche.

Una pipeta de patch es lo suficientemente grande como para permitir el lavado del citoplasma por la solución de registro.Ya que el volumen de una célula es pequeño comparado con la pipeta de parche, la composición del fluido intracelular puede ser considerado igual al de la solución de registro que llena la pipeta. Si lo que se desea es emular una situación fisiológica, entonces la pipeta deberá ser llenada con una solución de composición iónica que se acerque lo más posible a la composición interna de la célula.

Es necesario considerar que la manipulación del medio interno de la célula puede ser tan bueno como malo, dependiendo por supuesto, de lo que se desee obtener, ya que es probable que en algunos casos, factores citosólicos importantes para el funcionamiento del canal, puedan ser removidos o "diluidos" a tal punto que afecten el comportamiento de nuestra proteína de estudio. Para evitar este problema, en muchos casos es posible aplicar parche perforado, donde el contacto eléctrico con el citosol es establecido por la adición a la pipeta de agentes perforadores de membrana. Agentes perforadores como la nistatina o la amfotericina B perforan la membrana, por lo que solamente moléculas pequeñas como los iones pueden pasar a través de los agujeros producidos, manteniendo de este modo la composición citoplasmática intacta, en cuanto a su composición orgánica. 

Figura 1: Registro en condiciones de whole cell. Como se ve en el esquema, para llegar a la configuración de célula completa, es necesario primero pasar por cell attached. Una vez perforada la membrana tras una suave succión, todos los canales de la célula podrán ser analizados bajo esta condición. Por lo tanto, nunca podremos registrar canal único pero sí obtendremos corrientes macroscópicas.

Imagen obtenida desde 
http://butler.cc.tut.fi/~malmivuo/bem/bembook/

Cell attached

Es la configuración más simple del patch clamp en términos de manipulación física. Todos los experimentos de patch clamp comienzan con esta situación. La pipeta se posiciona sobre la membrana celular donde se consigue una muy buena conexión generando un sello de alta resistencia (del orden del giga ohm). Según el tamaño de la pipeta, esta puede lograr la conexión con un canal (canal único) o con varios canales (macro parche).

Esta configuración permite la manipulación de la célula intacta, lo que impide la posibilidad de cambiar fácilmente la composición del medio interno (intracelular). Por otra parte, ya que la pipeta se comporta como el medio extracelular, la composición de ésta puede ser modificada según las necesidades del investigador.

Figura 1: Configuración cell attached. En esta figura se puede ver que la boca de la pipeta logra conectarse con un sector de la membrana que presenta un canal, por lo tanto, el registro que se obtenga para este caso, será un registro de canal único.

La técnica del patch clamp

La técnica del patch clamp fue descrita por Neher y Sackmann en 1983 (1). La eficiencia de esta técnica  requiere que la membrana esté libre, es decir, separada de otras células, libre de tejido conjuntivo, de restos celulares, etc, para que de esta forma, la pipeta se pueda adherir de una manera eficiente a la membrana celular. 

Las pipetas son preparadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato y confeccionadas a través de un puller, el cual es programado para dividir el capilar en dos, generando así en el sector de la división, finísimas puntas, las que más tarde serán refinadas con calor para suavizar el contorno, lo que también permitirá una mejor adhesión del vidrio a la membrana.

Una vez que el vidrio hace contacto con la membrana, se aplica una suave succión lo que permite que parte de la membrana se invagine en la pipeta provocando una firme unión entre la membrana y el vidrio,  generando un aumento en la resistencia desde unos pocos meha ohm a valores que superan el giga ohm. De esta forma se produce un aislamiento perfecto entre la pipeta y la región de la membrana que se mantiene adherida, haciendo posible que se realicen cambios de potencial sólo en esta región aislada. 

Las diferentes configuraciones del patch clamp, faculta al investigador a:

• Estudiar los canales iónicos en diferentes niveles, por ejemplo, se peude tanto utilizar la técnica de whole cell (célula completa) para analizar la actividad de todos los canales de la célula como realizar registros de canal único.

• Manipular fácilmente la composición tanto del medio extracelular como del intracelular durante un registro.

 Los diferentes modos del patch clamp son:

1. Cell attached (adherida a la célula)
2. Whole cell (célula completa)
3. Outside out (exterior hacia afuera)
4. Inside out (interior hacia afuera)

Los modos 3 y 4 pertenecen a la configuración de parche escindido.

(1) Sackmann, B., Neher, B. 1983. Single channel recording. Plenus Press. New York and London

Modos de registros y sus circuitos equivalentes

Las técnicas electrofisiológicas para registrar un flujo de iones a través de la membrana se pueden dividir en métodos indirectos que emplean electrodos extracelular, como en muchos métodos no invasivos como el electroencefalograma (figura 1) y métodos directos que utilizan micropipetas para hacer contacto con la célula de interés. En este último método se incluyen las técnicas de registro intracelular donde la pipeta penetra la célula y el patch clamp, donde la pipeta sólo hace contacto con la célula sin penetrar (figura 2).

Las propiedades de cada uno de los modos de registros pueden ser analizados con ayuda de representaciones electrónicas o circuitos equivalentes.

Figura 1: La electroencefalografía (EEG) es una exploración neurofisiológica que se basa en el registro de la actividad bioeléctrica cerebral en condiciones basales de reposo, en vigilia o sueño, y durante diversas activaciones mediante un equipo de electroencefalografía.

Figura 2: El patch clamp es una técnica electrofisiológica que permite el estudio de la corriente iónica que pasa por canal único o por múltiples canales lo que se conoce como corriente macroscópica.