Métodos para estudiar la epilepsia

Aproximadamente el 10% de los casos de epilepsia tipo GEFS+ (ver la entrada Epilepsia y Canales de Sodio Activados por Voltaje) son provocados por mutaciones en el gen SCN1A, mientras que para la epilepsia tipo DS el 85% de los casos corresponden a mutaciones y deleciones en el canal de sodio. Si deseas revisar más acerca de las mutaciones que se han descubierto, te recomiendo que visites la siguiente página http://www.molgen.ua.ac.be/SCNA1Mutations/. 

Hasta la fecha, se han encontrado aproximadamente 30 mutaciones en SCNA1, siendo casi todas de tipo missense. En muchos casos, estas mutaciones alteran pero no anulan la función del canal. Por otra parte, para el caso de DS se han encontrado más de 600 mutaciones que afectaría el gen SCN1A, algunas de las cuales serían responsables de provocar corrimientos en el marco de lectura, otras serían mutaciones del tipo nonsense y otras causarían errores en el splice-site.

Pero, ¿de qué manera alteran estas mutaciones la función del canal de sodio?

Para responder a esta pregunta los científicos han seguido varios métodos de investigación, siendo el primero de ellos el uso de un sistema de expresión heteróloga, es decir, expresan las proteínas de interés en sistemas celulares tales como ovocitos de Xenopus laevis, células HEK-293 o tsA201 para posteriormente analizar el comportamiento y alteraciones del canal y sus respectivas mutantes por medio de técnicas electrofisiológicas. Este método ha demostrado que estas mutaciones alteran el comportamiento del canal de muchas maneras diferentes, por ejemplo, la mutante R1648H acelera la recuperación de la inactivación del canal, mientras que la W1204R cambia la dependencia de voltaje de la activación e inactivación a potenciales más negativos. Por su parte, la R859C cambia la dependencia de voltaje de la activación a potenciales más positivos y T875M aumenta la inactivación lenta. Así, de un modo general podríamos decir que las alteraciones causadas por R1648H y W1204R incrementan el funcionamiento del canal generando una mayor excitabilidad neuronal, mientras que R859C y T875M provocan el fenómeno adverso, es decir, una disminución en la función del canal y en la excitabilidad neuronal.

El otro método, estudia el funcionamiento de la proteína en ratones transgénicos. Es así como en el año 2006, Yu y su grupo, generaron un ratón que presentaba epilepsia de tipo DS mediante la interrupción del gen Scn1a. Los mutantes heterocigotos (Scn1a^+/-) presentaban un 50% del nivel normal de expresión de la proteína Nav1.1 exhibiendo además ataques espontáneos y una alta mortalidad luego de 4 semanas se haber nacido (Yu et al., 2006). Por su parte, los mutantes homocigotos carecían completamente de Na_V1.1, y mostraban episodios de ataxia mientras que la tasa de muerte aumentaba bruscamente luego de los 15 días de nacido. Análisis electrofisiológicos en las neuronas piramidales de ratón knock out para SCN1A revelaron niveles normales de corriente de sodio, indicando que en estas neuronas el canal Na_V1.1 no contribuye de manera significativa a las corrientes de sodio. Sin embargo, en las interneuronas del hipocampo la corriente de sodio fue significativamente reducida, lo cual es crítico para la inhibición neuronal mediada por GABA. Además, las neuronas de Purkinje del cerebelo también muestraron una significativa disminución en la corriente de sodio sin que con esto se evidencien cambios en la cinética o en la dependencia de voltaje de la activación o inactivación del canal (Kalume et al., 2007). Ésta podría ser entonces, la explicación de la severa ataxia que sufre el ratón. Por otra parte, en el ratón knock out también se aprecia un incremento en la expresión del canal Na_V1.3 lo cual podría ser una manera de compensar la falta de Na_V1.1, sin embargo este resultado no era muy esperado pues Na_V1.3 es altamente expresado en el desarrollo embrionario, pero disminuye a niveles no detectables en el ratón adulto. Este antecedente aún está en discusión pues no se tiene muy claro el papel que cumpliría el aumento de la expresión de Na_V1.3 en la patogénesis de la epilepsia en el ratón.

Más tarde, durante el año 2007 se creó un segundo ratón modelo por el grupo de Ogiwara, quien incorporó en el animal un gen SCN1A que presentaba un codón de término prematuro (R1407X). Esta mutación se ha encontrado en varios pacientes con epilepsia. Los ataques espontáneos, están presentes tanto en las ratas homocigotas como en los heterocigotas y además en ambos se observa una disminución en la expresión de canal Na_V1.1.

A modo de conclusión, se puede señalar que los resultados en ambos modelos de ratones Knock out son consistentes mostrando en ambos casos una reducción en la inhibición neuronal, por lo que al parecer éste sería el fenómeno que contribuiría de manera primordial a los ataques espontáneos severos en ambas ratas, característica que se encuentra directamente asociada  con la epilepsia tipo DS.

Si deseas revisar más a fondo el tema, te recomiendo los siguientes artículos:

• Sodium channel SCN1A and epilepsy: Mutations and mechanisms.
• Reduced sodium current in Purkinje neurons from Nav1.1 mutant mice: implications for ataxia in severe myoclonic epilepsy in infancy.
• Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.
• Na(v)1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation.

Epilepsia y Canales de Sodio Activados por Voltaje.

Las canalopatías o patologías causadas debido a alguna mutación en los canales iónicos, son las responsables de algunos de los procesos que afectan al sistema nervioso central y neuromuscular.

Los canales de sodio activados por voltaje (ver figura), son esenciales para el inicio y la propagación del potencial de acción en neuronas. El canal del sodio está constituido por una subunidad alfa de aproximadamente 2000 residuos aminoacídicos y por una o dos subunidades beta de aproximadamente 220 aminoácidos, de las que hasta ahora se conocen cuatro formas (b1-b4). La subunidad a presenta 4 dominios estructuralmente homólogos (DI-DIV), cada uno de los cuales está formado por 6 segmentos transmembrana (S1-S6). Los segmentos transmembrana S5-S6 junto a su respectivo lazo de unión extracelular, son los encargados de formar el poro del canal, el cual tendrá como tarea controlar la selectividad y permeabilidad iónica. Además, a lo largo de cada uno de los segmentos S4 del canal, luego de tres residuos se encuentra un aminoácido cargado positivamente (arginina o lisina). El movimiento de estas cargas en respuesta a cambios en el potencial de membrana da origen a las corrientes de compuerta o corrientes de gating. Por esta razón se ha determinado que estas zonas corresponderían a los sensores de voltaje del canal, provocando la rápida activación del mismo en respuesta a la despolarización de la membrana. Después de la despolarización, el canal no es capaz de abrirse nuevamente sino hasta que haya transcurrido un cierto tiempo. Esta inactivación sigue dos tipos de cinética: la inactivación rápida, que tiene lugar al cabo de unos milisegundos, y la inactivación lenta, que se asocia a una corriente de sodio tardía o sostenida durante cientos de milisegundos. Algunas de las regiones del canal de sodio responsables de la inactivación rápida son la zona IFM ubicada entre DIII y DIV, la zona de unión intracelular entre S4-S5 de DIII y DIV y por supuesto, el poro del canal.

Cada subunidad a del canal de sodio lleva asociado una o más subunidades b, las cuales son glicoproteínas que presentan sólo un dominio transmembrana con un prominente amino terminal extracelular y un pequeño carboxilo terminal intracelular. La asociación de la subunidad b a la subunidad a, presenta más que nada una función regulatoria ya que principalmente influye en el nivel de expresión del canal en la superficie celular, en la dependencia de voltaje y en la cinética de la subunidad a, así como en su asociación con moléculas de señalización y del citoesqueleto, no obstante, la sola expresión de la subunidad a, es necesaria y suficiente para formar canales de Na⁺ funcionales. 

Subunidades a y b del canal de sodio activado por voltaje donde los cuatro dominios homólogos de la subunidad a se representan por un color diferente. Imagen tomada de J Clin Invest. 2005; 115(8):2010 doi:10.1172/JCI25466.

Hasta la fecha se han detectado más de 200 mutaciones diferentes en los canales de sodio de pacientes que sufren algún grado de epilepsia. A continuación veremos algunos ejemplos:

-         Mutaciones en el canal de sodio y el GEFS+

GEFS significa síndrome de epilepsia generalizada con convulsiones febriles plus. Es una epilepsia dominante caracterizada por convulsiones febriles en niños, la cual progresa en el tiempo hasta convertirse en una epilepsia generalizada en adultos. El síndrome se describió inicialmente en una familia que presentaba 25 individuos afectados. Dentro de la familia se podían detectar varios fenotipos siendo más frecuente el de ‘convulsiones febriles plus’ (CF+) en niños con convulsiones febriles de inicio precoz que persistían más allá de los seis años, esto venía acompañado de crisis generalizadas tonicoclónicas y solía cesar en la adolescencia media. Otros posibles fenotipos se relacionaban con diversos tipos de crisis como ausencias (CF+ y crisis de ausencias), mioclonías (CF+ y crisis mioclónicas), crisis atónicas (CF+ y crisis atónicas), epilepsia mioclónicoastática y crisis parciales complejas del lóbulo temporal (CF+ y epilepsia del lóbulo temporal).

La primera conexión entre la epilepsia y los canales de sodio se publicó en el año 1998 por el grupo de Wallace, R (Nat. Genet.1998.19:366-370) a partir de una mutación de la subunidad b1 en una familia Australiana. Los miembros de la familia afectada eran heterocigotos para una mutación missense (tipo de mutación en la que se necesita el cambio de una base nucleotídica para cambiar un aminoácido por otro) que correspondía a C121W. El canal mutante promovía la expresión de la subunidad a en la superficie celular pero no exhibía una modulación normal ni del funcionamiento del canal ni de su adhesión celular. Otro tipo de mutación que causa el mismo fenotipo, consiste en la pérdida de aminoácidos desde el domino extracelular de b1. Se piensa que mutaciones en b1 promoverían la inactivación anormal del canal de sodio provocando de este modo, una hiperexitabilidad neuronal propia de la epilepsia.

Posteriormente, en 1999, se descubrió que en dos familias que presentaban epilepsia, no era la subunidad b la afectada si no el gen SCN1A, es decir, el gen encargado de codificar para la subunidad a. Se encontró que los individuos afectados eran heterocigotos para mutaciones missense en aminoácidos altamente conservados como T875M y R1648H. Desde ese momento, se han reportado al menos 11 mutaciones missense en SCN1A para familias que presentan GEFS+, lo que corresponde a aproximadamente el 10% de los casos descritos.

-         Mutaciones en el canal de sodio y SMEI

En el 2001, en 7 pacientes que padecían de Epilepsia mioclónica severa de la infancia (SMEI) Peter De Jonghe y sus colaboradores (Am. J. Hum. Genet. 2001. 68:1327-1332) se encontraron mutaciones en el gen SCN1A. EMGI o también conocido como síndrome de Dravet constituye una de las formas de epilepsia más graves de la infancia. Suele comenzar entre los 3 y 10 meses de edad, con convulsiones que son cada vez más frecuentes y con menos fiebre; sumándose posteriormente mioclonías diarias, especialmente al despertar y crisis focales, todo eso acompañado de un importante deterioro mental. Hasta el 2005 se había detectado más de 150 mutaciones en SCN1A correspondientes a casi la mitad de los pacientes con SMEI. Al igual que en el caso de GEFS+, los pacientes son heterocigotos para los alelos mutantes. El espectro de mutaciones en SMEI difiere de las presentes en GEFS+ ya que aproximadamente la mitad de las mutaciones encontradas en pacientes con SMEI son non-sense, en las cuales se cambia un codón codificante por un codón de término, generando una proteína de menor tamaño con respecto a la original. Estas mutaciones son aleatorias y se pueden distribuir tanto en el amino terminal como en los segmentos transmembrana, o en los lazos citoplasmáticos o en el carboxilo terminal. El resto de las mutaciones son missense lo que conlleva el cambio de  un aminoácido por otro, las que como en GEFS+, se concentran en los segmentos transmembrana de la proteína.

-         Mutaciones en el gen SCN2A

Aunque los genes SCN1A y SCN2A están fuertemente relacionados, presentando un tamaño y una organización de sus exones bastante similar, hasta la fecha sólo unas pocas epilepsias han sido detectadas por mutaciones en SCN2A. Esto tal vez se puede deber a que en la mayor parte de los pacientes los análisis se habían enfocado en el gen SCN1A. Así, en pacientes con ataques epilépticos del tipo neonatal-infantil familiar benigno, el cual corresponde a un síndrome suave que se presentan en el primer año de vida pero que no progresa a epilepsia en el adulto, se ha encontrado varias mutaciones de tipo missense. Por otra parte, en el 2004 se encontró en pacientes que presentaban Epilepsia rebelde parecida al SMEI, una mutación que provocaba la aparición anticipada de un codón de término, generando una subunidad a de menor tamaño con respecto al canal de sodio silvestre. (Neurosci. 2004. 24:2690-2698).

-         Mutaciones en el gen SCN8A y los movimientos desordenados.

Determinadas mutaciones en el gen SCN8A de ratón, provoca desorden en los movimientos ya sea ataxia, distonía y/o temblores. Ciertos experimentos de inactivación condicional del gen en las neuronas cerebelares provocan una ataxia mucho más suavizada (Genesis. 2004. 39:234-239). En humanos, se ha revisado a aproximadamente 150 pacientes con desorden en el movimiento, encontrando mutaciones que generan una proteína truncada lo que probablemente causa la pérdida de función del canal (http://www.ashg.org/genetics/ashg04s/index.shtm).

De esta forma, luego de lo expuesto, queda en evidencia la importancia del correcto funcionamiento y expresión de una proteína tan importante como es el canal de sodio, ya que una simple mutación puede provocar irregularidades en la tasa de disparo de los potenciales de acción, lo que como ya hemos visto, puede afectar directamente en nuestras funciones tanto emocionales como cognitivas.

Para los más interesados, dejo el enlace donde podrán descargar el artículo de referencia.

http://www.jci.org/articles/view/25466/pdf