QX314 permitiría bloquear el dolor

No es una novedad que la medicina cuenta con una gran variedad de anestésicos, los cuales claramente son una ventaja ya que nos alivian el dolor pero también tienen un problema no menos importante, la escasa especificidad. Así, cuando vamos a un dentista y nos aplica un anestésico,  estamos bloqueando todos los canales de sodio gatillados por voltaje en un nervio. Estas proteínas promueven con su apertura un flujo de iones de sodio a través de la membrana lo que permite la despolarización de la membrana celular y la generación de potenciales de acción. Así que cuando se bloquean todos los canales de sodio, también bloqueamos muchas otras sensaciones. Recuerda que un nervio es un conjunto de axones neuronales que se encuentran asociadas en fascículos por medio de tejido conjuntivo, por lo tanto, al inyectar el anestésico en algún nervio, se bloquean todas las neuronas contenidas en él, las que estarán a cargo de numerosas funciones que se verán afectadas e inhibidas por el bloqueo de los canales de sodio. Recientemente, sin embargo, ciertos canales de sodio han sido identificados por encontrarse solamente en las neuronas sensibles al dolor, es decir, en neuronas nociceptivas (Cummins et al., 2007).

El canal iónico TRPV1, como ya hemos visto en entradas anteriores, es gatillado por capsaicina o por temperaturas superiores a 42 ºC, entre otros tantos estímulos. El poro de este canal es bastante promiscuo. Aun cuando no deja pasar aniones, permite el tránsito de una enorme gama de cationes, incluso algunos bastante grandes como un anestésico local. Normalmente, los anestésicos locales son moléculas que pasan a través de la membrana lipídica sin necesitar para esto ni canales ni transportadores. Justamente es por este motivo que todos los canales de sodio dependientes de voltaje en todas las neuronas de un mismo nervio son bloqueados al asociarse al vestíbulo interno del poro del canal. Sin embargo, existe un anestésico llamado QX-314, el cual no es capaz de atravesar la membrana lipídica ya que presenta cargas positivas que lo hace impermeable, esto impide que el anestésico bloquee los canales de sodio cuando es aplicado de manera externa.
¿Podría entonces QX314 entrar por los canales TRPV1 y de esta manera unirse sólo los canales de sodio presentes en las neuronas nociceptoras y de este modo, sólo bloquear el dolor y no otras funciones como movimiento, gusto, etc? La respuesta es SÍ. Si se inyecta simultáneamente capsaicina el cual abre el canal TRPV1 más QX314, éste podrá pasar por el poro del canal (figura 1). 

Figura 1: QX314 es un anestésico local cargado, el cual no puede atravesar la bicapa lipídica por si solo. Para poder llegar al interior celular requiere la presencia de TRPV1, canal iónico que es abierto gracias a la presencia de capsaicina. Una vez dentro, QX314 puede unirse al vestíbulo interno de canales de sodio ubicadas específicamente en neuronas nociceptivas, ya que TRPV1 es expresado sólo en éste tipo de células nerviosas. De este modo, se ha demostrado que (Binshtok et al., 2007) administrando una mezcla de QX314 y capsaicina, actúa como analgésico, silenciando la sensación de dolor sin afectar otras respuestas nerviosas. Imagen tomada de McCleskey, 2007.

De hecho, se ha probado que cuando se inyecta en un pie o se perfunde en un nervio de rata, la mezcla capsaicina más QX314, se inhibe la sensibilidad del animal a estímulos térmicos nocivos o mecánicos dolorosos, sin causar parálisis. Esta analgesia dura un par de horas (Binshtok et al., 2007). El QX314 aún no se prueba en humanos ya que primero es necesario encontrar la dosis ideal de capsaicina a usar, pues cualquier aumento en su dosis, podría provocar algún tipo de daño. Además se necesita determinar con exactitud la permeabilidad de TRPV1 a QX314, ya que hasta ahora, esta droga sólo ha sido usada in vitro por biólogos dedicados al estudio de canales iónicos.

Mecanismos celulares y moleculares de la quimiosensación trigeminal

En esta revisión, Kristin A. Gerhold y Diana M. Bautista explica de manera muy general cómo las neuronas somatosensoriales consiguen detectar estímulos como temperatura e irritantes químicos, entre otros y cómo por medio de compuestos naturales se puede llegar a descubrir el mecanismo molecular de la somatosensación.

El archivo original lo puedes encontrar en el siguiente enlace

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2879328/

Las neuronas somatosensoriales del ganglio trigémino principalmente nos permiten detectar estímulos térmicos, mecánicos y químicos en diversas regiones de la cabeza y en las zonas cercanas a ella.  Estudios demuestran que la mayor función del sistema trigeminal se encuentra en la quimiosensación de la mucosa oral y nasal. Es así como personas o animales que presentan anosmia, es decir, pérdida o disminución de su capacidad olfativa, no muestran una disminución en su capacidad para detectar irritantes químicos vía el sistema trigeminal, siendo por este motivo que una de las principales estrategias para estudiar la somatosensación consiste en utilizar compuestos provenientes de plantas con el propósito de descubrir el mecanismo molecular fundamental responsable tanto de la detección térmica como de la química. Tal ha sido el caso de compuestos como la capsaicina y del mentol, los cuales han servido para identificar dos canales de iones que juegan un importante rol en la función somatosensorial.

Capsaicina

El fruto proveniente del género Capsicum provoca un efecto de ardor localizado en quienes lo consumen y el responsable de esta sensación es la capsaicina u 8-metil-N-vanillil-6-nonenamida  (compuesto activo) la cual provoca una variedad de efectos como dolor agudo, vasodilación, hiperventilación y cambios en la presión arterial. Un efecto similar puede ser provocado por la resiniferotoxina, el cual es un análogo de capsaicina aislado de la Euphorbia resinifera, una planta del tipo de los cactus. Tempranos estudios sugieren que la capsaicina ejerce sus efectos por activación de un receptor en un subgrupo de neuronas somatosensoriales que detectan calor nocivo. Sin embargo, no fue hasta 1997 que Caterina et al. usando la estrategia de clonado y expresión identificó un miembro de la familia de canales iónicos conocida como receptores de potencial transitorio (TRP), llamado TRPV1 como un receptor de capsaicina.

TRPV1, es un canal catiónico no selectivo que se comporta como un rectificador de salida al igual que todos los demás miembros de la subfamilia TRPV con excepción de TRPV5 y TRPV6. TRPV1 es activado por capsaicina mediante la unión de éste a una región del canal formada por los residuos de aminoácidos R491, Y511 y S512 ubicados en los segmentos transmembrana 2 y 3.

TRPV1 se encuentra altamente expresado en neuronas sensoriales primarias tanto en el ganglio trigémino como en las de la raíz dorsal siendo además activado por temperatura, con un umbral de activación de aproximadamente 43 ºC y con un coeficiente de dependencia de la temperatura (Q10) mayor a 20, lo cual lo vuelve por cierto en un canal altamente sensible a la temperatura considerando que el Q10 de gran parte de los canales es de 1-2. Por otra parte TRPV1  puede ser modulado por una amplia variedad de mediadores inflamatorios provenientes de algún daño en el nervio (injuria) o inflamación incluyendo protones, segundos mensajeros derivados de lípidos como la anandamida y péptidos bioactivos como bradiquinina. Análisis de animales deficientes de TRPV1 revelan que este canal presenta un papel importante tanto en la detección del calor intenso como en la hipersensibilidad térmica seguida del daño e inflamación. Además la eliminación genética de TRPV1 atenúa la respuesta al calor nocivo y a la capsaicina tanto a nivel celular como conductual, por lo que se estima que TRPV1 actuaría como un integrador polimodal tanto de calor como de estímulos químicos.

Mentol

El mentol es un alcohol secundario saturado que corresponde al componente activo de la menta. En 1951, Hensel y Zotterman demostraron que el mentol actúa directamente en neuronas somatosensoriales sensibles a frío. Ellos ya en ese tiempo plantearon a modo de hipótesis que el mentol alteraba la actividad de las proteínas involucradas en la transducción del frío. Fue así como en el 2002, McKemy et al. usó mentol para investigar las moléculas encargadas de mediar la detección de temperaturas bajas. Nuevamente, usando la estrategia de clonado y expresión, ellos identificaron otro miembro de la familia TRP, TRPM8, como la molécula blanco de la acción del mentol. Luego, estudios de mutagénesis revelaron que residuos de aminoácidos ubicados en el segmento transmembrana 2 y 4, además de algunos residuos situados en la caja TRP ubicada en el carboxilo terminal eran cruciales para la acción del mentol. 

Se ha determinado que TRPM8 expresado de manera heteróloga comparte propiedades fisiológicas con los receptores de frío nativos, tales como un umbral térmico de aproximadamente 25 ºC y la activación por mentol, entre otras, lo que ha permitido establecer una caracterización muy detallada del canal. Además de mentol, TRPM8 es activado por icilina (AG 3-5), el cual es unas 300 veces más potentes en la activación del canal que el mentol. 

Una demostración importante de la participación de TRPM8 en la sensación de frío se ha obtenido por medio del análisis de neuronas sensoriales aisladas de ratas knockout para este canal. Las neuronas presentan respuestas atenuadas a mentol, icilina y frío. Además, estudios conductuales muestran una severa deficiencia en las respuestas evocadas por frío en estas ratas. Sin embargo, existen evidencias que señalan que TRPM8 no sería el único encargado de la transducción por frío ya que por una parte ratas deficientes de TRPM8 muestran una actividad normal a temperaturas menores a 10 ºC y por otra, se ha visto que existe una "nueva" población de neuronas sensibles a frío pero insensibles a mentol, las cuales presentan un umbral de temperatura mucho más bajo que aquellas que expresan TRPM8. Se piensa que tal vez el responsable de la detección de este frío nocivo, sería TRPA1.

Aceite de mostaza

Se trata del aceite vegetal que proviene del prensado en seco de las semillas de la mostaza (Brassica nigra) siendo su compuesto activo una variedad del isotiocianato al igual que para el caso del wasabi y del rábano picante. La aplicación tópica de aceite de mostaza provoca la activación de las neuronas somatosensoriales provocando un dolor agudo y una inflamación neurogénica a través de la liberación periférica de neuropéptidos desde la terminal nerviosa aferente primaria, lo que resulta en hipersensibilidad a la temperatura y a los estímulos mecánico. Aunque las consecuencias fisiológicas de la exposición a aceite de mostaza eran bien conocidas, no se tenía antecedentes sobre los sitios moleculares y celulares sobre los que actuaba el isotiocianato. Fue así como en el 2004, Jordt y su grupo descubrieron otro miembro de la familia de canales de iones TRP, el TRPA1, el cual era efectivamente activado por isotiocinato y sus derivados. TRPA1 es altamente expresado en un subgrupo de neuronas sensibles a capsaicina y es originalmente propuesto como un posible transductor de frío nocivo. TRPA1 es también activado por tiosulfinato, componente activo del ajo y otros miembros del género Allium, por cinamaldehído que es el compuesto picante de la canela y por el tetrahidrocannabinol (THC) que es la principal sustancia psicoactiva encontrada en las plantas de la especie Cannabis sativa. Análisis de ratas deficientes de TRPA1 muestran que esta proteína es requerida tanto para la respuesta aguda al aceite de mostaza como para la hipersensibilidad térmica seguida de la exposición al isotiocianato. TRPA1 es también modulada por la respuesta inflamatoria provocada por formalina, tiosulfinatos, cinamaldehído y por el aldehídos α,β-insaturados como la acroleína compuesto que encontramos en el gas lacrimógeno, en el gas proveniente del tubo de escape de los autos y en el smoke. Estos diversos agonistas activan el TRPA1 a través de modificaciones covalentes de cisteínas en el dominio intracelular del C-terminal del canal.  Así, en general, TRPA1 aparece por actuar como un sensor del estado inflamatorio y del frío nocivo.

Para mayores detalles, revisa el enlace donde podrás descargar directamente el artículo y sus referencias

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2879328/

Algunas bases moleculares del dolor

Hace más de 100 años, Sherrington (Levine, 2007) propuso la existencia del nociceptor, es decir, neuronas sensoriales primarias que traducen estímulos nocivos en potenciales de acción y que conducen esta señal eléctrica desde su sitio de estímulo hasta la médula espinal. Más tarde, estudios electrofisiológicos determinaron que efectivamente existían tales neuronas, las cuales podían ser estimuladas por ejemplo mediante un calor nocivo, una presión intensa o por químicos que pudieran provocar irritación.

Las fibras que inervan regiones de la cabeza y del cuerpo, surgen desde los cuerpos celulares del ganglio trigémino y del ganglio de la raíz dorsal (DRG), respectivamente. Cuerpos celulares con grandes diámetros dan lugar a fibras mielinizadas, llamadas fibras sensoriales primarias Ab, las cuales presentan una alta velocidad de conducción. Muchas de estas fibras están encargadas de detectar estímulos inocuos aplicados a la piel, músculos y articulaciones, por lo que no contribuyen a percibir el dolor. Al contrario, células de diámetro pequeño o mediano dan lugar a los nociceptores, los que incluyen las fibras C no mielinizadas, las cuales son conductores lentos y las fibras Ad, las cuales son suavemente mielinizadas y por lo tanto conducen más rápido que las fibras C. Esto permite asumir que nociceptores Ad actuarán primero frente a un dolor agudo, punzante mientras que los nociceptores C, actuarán un poco más lento, provocándonos aquel dolor que es un poco más difuso y que permanece durante más tiempo (figura 1). 
Existen principalmente dos tipos de nociceptores Ad, ambos responden a un estímulo mecánico intenso, pero pueden ser distinguidos por su respuesta diferencial frente al calor. Con respecto a las fibras C, éstas son mayoritariamente nociceptores polimodales, respondiendo tanto frente a temperatura como a estímulos mecánicos. Otros son mecánicamente insensibles pero responden a estímulos térmicos nocivos. Además, muchos nociceptores C también responden a estímulos químicos nocivos tales como ácido o capsaicina (compuesto activo del ají), entre otros.

Figura 1: Diferentes nociceptores detectan diferentes tipos de dolor. A. nervios periféricos incluyen fibras aferentes mielinizadas de pequeño (Ad), medio y gran diámetro ( Ab), así como fibras aferentes no mielinizadas de pequeño diámetro (fibras C). B.La velocidad de conducción está directamente relacionada al diámetro de las fibras. Imagen tomada de Julius and Basbaum, 2001.


Todos los sistemas sensoriales, vista, tacto, oído, gusto y olfato, pueden convertir un estímulo ambiental en una señal eléctrica. Por lo general, las neuronas sensoriales primarias sólo pueden detectar un estímulo, como luz, olores, sonidos, etc, sin embargo, el caso de la nocicepción es único, ya que debe detectar una amplia modalidad de estímulos los que pueden ir desde un estímulo químico nocivo como algún tipo de daño causado por un ácido hasta alguna temperatura perjudicial. Además, los nociceptores no sólo están encargados de sentir estímulos dolorosos, sino que también contribuyen en condiciones de dolor patológicas y persistentes (alodinia) las que ocurren luego de habernos causado algún daño. Por ejemplo, cuando sufrimos una quemadura, pasado el tiempo dejamos de sentir ese dolor punzante, sin embargo, si nos tocamos en la zona dañada es probable que nuevamente un simple roce que en condiciones normales no nos provocaría dolor, ahora genere daño. La alodinia puede resultar de dos condiciones diferentes:
- Incremento en la respuesta de las neuronas encargadas del dolor, ubicadas en la médula espinal (sensibilización central).
- Disminución en los umbrales de activación de los nociceptores (sensibilización periférica).

En el caso de la sensibilización central, el dolor puede ser producido por la actividad de fibras sensoriales primarias no nociceptivas. La sensación periférica en cambio, es producida cuando las terminales de los nociceptores se ven expuestas a los productos del daño e inflamación de tejidos, lo que se conoce como “sopa inflamatoria”  (figura 2). Dentro de los productos que se liberan, se incluyen protones extracelulares, ácido araquidónico y otros metabolitos lipídicos, serotonina, bradiquinina, nucleótidos y NGF, todos los cuales interactúan con receptores o canales iónicos en las terminales nerviosas. Debido que los nociceptores pueden liberar péptidos y neurotransmisores (por ejemplo, sustancia P, péptido relacionado al gen de la calcitonina y ATP) desde sus terminales periféricas cuando son activados por estímulos nocivos, ellos facilitan la producción de la “sopa inflamatoria” por promover la liberación de factores desde las células no neuronales cercanas y del tejido vascular, fenómeno conocido como inflamación neurogénica.

Figura 2: Algunos de los compuestos presentes en la sopa inflamatoria. La activación de los nociceptores no sólo transmite mensajes aferentes al asa dorsal de la médula espinal (y desde aquí al cerebro) sino también inician un proceso de inflamación neurogénica. Esto es una función eferente de los nociceptores por medio del cual libera neurotransmisores, destacando la sustancia P y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) desde terminales periféricas induciendo la vasodilatación y la extravasación plasmática (filtración de proteínas y fluido desde vénulas y capilares), así como la activación de muchas células no neuronales, incluyendo mastocitos y neutrófilos. Estas células a su vez contribuyen con elementos adicionales a la sopa inflamatoria. Imagen tomada de Julius and Basbaum, 2001.

Los daños y lesiones incrementan la sensibilidad de los nociceptores tanto a estímulos térmicos como mecánicos. Este fenómeno resulta en parte de la producción y liberación de mediadores químicos desde las terminales sensoriales primarias y desde células no neuronales (por ejemplo, fibroblastos, neutrófilos y plaquetas) en el ambiente. Algunos componentes de la sopa inflamatoria (por ejemplo, protones, ATP, serotonina y lípidos) pueden alterar la excitabilidad neuronal directamente por interacción con canales iónicos o superficie nociceptora, mientras otros (como bradiquinina y NGF) se unen a receptores metabotrópicos y median sus efectos a través de cascadas de señalización con segundos mesajeros.

La acidosis local es la marca fisiológica de una respuesta a un daño y el grado de dolor asociado es bien correlacionado a la magnitud de la acidificación (Reeh and Steen, 1996). La aplicación de ácido (pH 5) en la piel produce la descarga de componentes de la sopa inflamatoria, en un tercio o más de los nociceptores polimodales que inervan el campo receptivo. A un nivel celular, los protones despolarizan las neuronas sensoriales por activación directa de canales catiónicos no selectivos, en los que destaca el canal TRPV1 (Bevan and Geppetti, 1994), ubicado en las terminales nerviosas libres de los nociceptores. Los protones presentan dos efectos mayores en la función de este canal:

-         TRPV1 puede ser activado a temperatura ambiente cuando el pH extracelular baja de 6, es decir, cuando el ambiente se vuelve más ácido.

-         protones potencian la respuesta a la capsaicina y al calor, lo que provoca que el canal se active con concentraciones más bajas de capsaicina y a temperaturas inferiores de 43 ºC.

Así, estos cambios en la conducta de TRPV1 pueden provocar un incremento en la excitabilidad de los nociceptores provocando dolor.

De los péptidos bioactivos liberados desde células no neurales en el sitio de la lesión, destaca la bradiquinina la cual, cuando se aplica a terminales nerviosas sensoriales primarias o cultivo de neuronas sensoriales, producen despolarización de membrana de forma inmediata. La bradiquinina activa el receptor acoplado a proteína G (BK2) en estas células para estimular la hidrólisis catalizada por PLC de PIP2, con la consecuente liberación de calcio desde fuentes intracelulares (figura 3) y activación de la proteína quinasa C (PKC), la cual fosforila a TRPV1 potenciando su respuesta frente a capsaicina y a protones y además reduciendo la temperatura umbral de la activación de TRPV1. Bradiquinina también aumenta la sensibilidad de TRPV1 a través de un proceso independiente de PKC. En este mecanismo, la modulación del canal ocurre como consecuencia directa de la hidrólisis de PIP2 mediante PLC, lo que libera a TRPV1 de la inhibición mediada por PIP2.

Figura 3: PIP2 es hidrolizado por la fosfolipasa C (PLC) generando IP3 y DAG. Esto inicia la liberación de calcio intracelular y la activación de la proteína quinasa C (PKC) el cual fosforilará entre otros sustratos, a TRPV1.

Finalmente cabe destacar, que estudios realizados en ratas carentes de TRPV1 señalan que éstas presentarían irregularidades en cuanto a su sensibilidad frente a acidificación severa, mientras que cultivo de sus neuronas del ganglio de la raíz dorsal, muestran una reducida respuesta a protones (Caterina et al., 2000; Davis et al., 2000). De este modo, dado el bien establecido rol de TRPV1 en la vía del dolor, se a trabajado bastante con el fin de encontrar algún antagonista que inhiba la activación de este canal para aminorar de este modo esa sensación tan incómoda que es el dolor (Krause et al., 2005). Un ejemplo de estos avances, estudia el rol de TRPV1 en la generación de dolor causado por el sarcoma de huesos (ver Sarcomas del Hueso: Los Fundamentos). La activación de osteoclastos inducen la reabsorción de los huesos y a su vez, acidosis, la cual activa los canales TRPV1 ubicados en las fibras sensoriales de los huesos, provocándonos la sensación de dolor. En un modelo in vivo del dolor de cáncer de huesos, el tratamiento de ratas con un antagonista selectivo de TRPV1 llamado JNJ-17203212 produjo una importante disminución de los movimientos evocados por el dolor (Ghilardi et al., 2005). Similarmente, otro bloqueador selectivo de TRPV1, A-425619, es mostrado por ser una efectiva solución contra el dolor en algunos modelos de nocicepción patológica e hiperalgesia térmica (McGaraughty et al., 2006). Más aún, recientemente, SB-705498 fue reportado como un antagonista de TRPV1 con una buena biodisponibilidad oral y alta efectividad en reducir hiperalgesia y alodinia en animales modelos (Rami et al., 2006; Rami et al., 2004). Estos ejemplos se han realizado hasta ahora sólo en modelos animales, pero nos hacen pensar que estos potenciales antagonistas de TRPV1 también podrían ejercer  efecto en el tratamiento de diversas formas de dolor también en humanos. Otro mecanismo que se ha estudiado, es la inducción de la desensibilización de TRPV1 por desfosforilación via calcineurina. Este medio provee un mecanismo alternativo para combatir la hiperalgesia, tal como se demostró con el agonista del receptor CB1, el canabinoide WIN55,212-5 (Patwardhan et al., 2006).

Todo lo expuesto nos demuestra que TRPV1 presenta una función fundamental actuando como  integrador de diversas señales nociceptivas, por lo que hoy en día, se ha vuelvo tremendamente importante estudiar los antagonistas de TRPV1, los cuales serían de gran utilidad para desvelar la contribución de este receptor en el dolor y, por supuesto también, como posibles analgésicos.

Para mayor información, puedes revisar el siguiente artículo: El canal TRPV1 como diana para tratar el dolor. 

TRPM3 y sus respectivas variantes funcionales de splicing, son putativos osmosensores celulares

Resumen

            Para la vialidad celular, la rápida adaptación a la tonicidad extracelular es esencial y, junto con ello, la activación de una gran variedad de mecanismos celulares protectores del estrés osmótico. Recientemente se ha caracterizado TRPM3 (Transient Receptor Potencial Melastatin 3) (1). Este canal media la entrada de calcio en células epiteliales, luego de la aplicación extracelular de soluciones hipotónicas (2). Gracias a la modulación de este canal, las células epiteliales regulan su concentración iónica intracelular para adaptarse a las condiciones de su entorno y facilitar sus funciones celulares. La diversidad funcional de los canales iónicos se ha incrementado gracias a las variantes de splicing y a la heteromerización de subunidades regulatorias y formadoras del poro. En la familia de los TRPs, se han identificado muchas variantes de splicing, algunas de ellas, resultan en la carencia de respuestas a estímulos clásicos y otras modifican las propiedades de conducción. Una tercera posibilidad, consiste en ejercer un efecto dominante negativo, debido a la generación de un incremento exagerado en las concentraciones de calcio intracelular. TRPM3, presenta un gran número de diferentes variantes. Las primeras seis, fueron llamadas hTRPM3a-f (2), sin embargo, sólo se han reportado datos funcionales para hTRPM3a, el cual, excepcionalmente permite la entrada preferencial de cationes monovalentes, mientras que por el contrario, hTRPM3b presenta una selectividad por cationes divalentes, similar a la forma canónica. Además, se ha reportado una variante que presenta un total de 1325 residuos ya que su carboxilo terminal es considerablemente más corto (3). El amino terminal de esta variante, sin embargo, presenta 153 aminoácidos adicionales. En este último tiempo, se ha descrito cinco nuevas formas de TRPM3, TRPM3 1-5 (4). Estas, presentan un largo que va entre los 1699 – 1721 residuos aminoacídicos y además son caracterizadas por un amino terminal previamente desconocido de 61 residuos.

            Considerando la relevancia del canal TRPM3 en la fisiología epitelial y el gran número de formas que éstos presentan, se piensa que un cambio en la tasa de variantes de splicing generada por diversos factores (5,6) como diferencias en pH, cambios osmóticos o choques térmicos, podría modificar el funcionamiento de las células epiteliales. Así, gracias a los antecedentes recogidos y fundados en la activación dependiente de la osmolaridad de estos canales, es probable que tanto TRPM3 como sus respectivas variantes funcionales, actúen como putativos osmosensores celulares.

Introducción

La secuencia codificante de los genes eucarioticos (exones), son típicamente interrumpidos por muchas secuencias largas no codificantes (intrones) que son removidas del RNA durante el proceso de splicing para dar lugar al mRNA. Muy a menudo, estos eventos ocurren cuando el RNA aún se está transcribiendo, momento en el cual, se remueve un intrón y se unen los exones adyacentes, para dar un producto de RNA más corto (7).

La existencia de los intrones facilita la recombinación de exones para producir diferentes proteínas con nuevas funciones, más aún, existen células que utilizan splicing para controlar su expresión génica (8). Durante algún tiempo, se pensó que la complejidad de un organismo estaba dada por el tamaño del transcriptoma, sin embargo, hoy se sabe, que a pesar del bajo número de genes predichos en nuestro genoma (30.000) los procesos postranscripcionales y postraducionales, tienen una enorme importancia al momento de explicar la variabilidad funcional.

El splicing alternativo es un proceso multifactorial complejo, regulado tanto por la interacción de factores tales como proteínas ricas en serina-arginina (proteínas SR) y ribonucleoproteínas heterogéneas (proteínas hnRNP) con sus secuencias blanco en el pre-mRNA (enhancer y represores del splincing) así como también, por la velocidad de transcripción de la RNA polimerasa II (9). El splicing alternativo también actúa en respuesta a estímulos externos como pH, temperatura, metales iónicos y condiciones osmóticas, entre otros (10).

La maquinaria de Splicing

El splicing es un proceso que químicamente consiste de dos reacciones sucesivas de transesterificación. El corte y el empalme son dependientes de la hidrólisis de ATP y son catalizados por un gran complejo de ribonucleoproteínas llamado “spliceosoma”. Este proceso dará como resultado la formación del mRNA, que será transportado al citoplasma y en donde será traducido a proteína en el caso de que ocurra splicing constitutivo o bien, a diversas proteínas en el caso de que se lleve a cabo splicing alternativo. Este evento, se lleva a cabo en el núcleo, aunque hay reportes de que también puede ser citoplásmico (11).

El spliceosoma, es un largo complejo proteína - RNA, el cual consiste en 5 tipos de RNAs nucleares pequeños (snRNA) y más de 50 especies de proteínas, las que se combinan para formar las ribonucleoproteínas pequeñas (snRNP)(12).

Durante el splicing, el spliceosoma reconoce secuencialmente tres posiciones en el RNA a través de un apareamiento de bases con el snRNA, que corresponde a los dinucleótidos GU y AG en los lugares de unión exón-intrón (sitios de splicing 5’) e intrón y exón (sitios de splicing 3’), respectivamente. El punto de empalme (branchpoint) es en general una adenina y mantiene una secuencia consenso. Entre el sitio de empalme y el sitio del dinucleótido AG, se encuentra una región rica en pirimidinas (uracilos, usualmente) llamada la región Py. En el primer paso de transesterificación, el grupo OH de la ribosa del residuo de adenina en el sitio de empalme, realiza un ataque nucleofílico hacia el sitio de splicing 5’, generando una ruptura del enlace fosfodiéster. Al mismo tiempo, la guanina del dinucléotido realiza un enlace a través de su extremo 5’ con el lado 2’ del residuo de adenina en el sitio de empalme. Después ocurre la segunda reacción de transesterificación, en la cual el grupo OH del extremo del exón realiza un ataque nucleofílico hacia el sitio de splicing 3’. Como resultado, se libera el intrón como una estructura en forma de lazo (lariat), al mismo tiempo que se unen los exones para generar el mRNA maduro. El intrón en forma de lariat se rompe nuevamente en su enlace 5’-2’ y se lineariza, posibilitando que sea degradado o bien procesado nuevamente para dar lugar a un RNA pequeño nucleolar rico en uracilo (UsnoRNA) (13) (Figura 1).

Figura 1. A) Flujo de la información genética. B) La reacción del splicing incluye dos pasos de transesterificación, en donde se requiere de ATP. En la reacción se libera el intrón y se ligan los exones.

Para que se lleve a cabo el splicing se requieren varios factores, que incluyen diferentes tipos de RNA y proteínas que son:

1. Los RNA pequeños nucleares cuyas longitudes oscilan entre 60 y 300 nucleótidos y son ricos en residuos de uracilo (UsnRNAs). Los cinco tipos son: el U1snRNA, el U2snRNA, el U4snRNA, el U5snRNA y el U6snRNA. El U3snRNA participa en eventos de maduración del pre-rRNA (RNA ribosomal inmaduro o precursor). Estos RNAs son transcritos por la RNA polimerasa II, salvo el U6snRNA, que lo transcribe la RNA polimerasa III. En el núcleo, los UsnRNAs se asocian con proteínas para formar ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (UsnRNPs).
2. Las partículas ribonucleoproteícas heterogéneas (hnRNPs) que contienen RNA heterogéneo nuclear (hnRNA), son estabilizadoras, es decir, su función radica en asociarse al pre-mRNA para impedir la formación de estructuras secundarias dadas por el apareamiento de bases. De ésta manera el pre-mRNA permanece accesible para interactuar con otras moléculas.

3. Las proteínas SR (proteínas con dominios ricos en Serina y Arginina) representan una familia de factores de splicing que se reporta en vertebrados, invertebrados y plantas.

La secuencia de aminoácidos en estas proteínas es rica en residuos de serina (S) y arginina (R) en el extremo carboxilo, formando el dominio SR. Estas proteínas tienen varios papeles reguladores en el splicing como son la definición de los sitios de splicing y el acercamiento de las regiones de los dinucléotidos. Estas proteínas nucleares de 20 a 75 kDa, tienen capacidad de fosforilarse y se subdividen en dos tipos, las de Tipo I, presentan un único Motivo de Reconocimiento a RNA (RRM) en el extremo amino-terminal y su dominio SR carboxilo Terminal, y las de Tipo II, las cuales presentan dos Motivos de Reconocimiento a RNA y un dominio carboxilo terminal SR. Además, existen otras proteínas que pueden o no tener una estructura distinta del Motivo de Reconocimiento a RNA.

En las células de mamíferos se han identificado y aislado componentes esenciales del splicing, tales como el factor SF2/ASF, el factor SC35 y el 9G8, los cuales han sido identificados por medio de anticuerpos monoclonales (14).

La figura 2 ilustra cómo los factores involucrados en este proceso, interaccionan con el pre-mRNA de manera secuencial, formando complejos ribonucleoproteicos transitorios que permitirán que ocurran los dos pasos de transesterificación. En el primer paso se forma el complejo E, que se caracteriza por: la unión del U1snRNA de la U1snRNP al sitio de splicing 5’; este sitio de reconocimiento, está dado por:

1. Una secuencia complementaria de U1snRNA con el sitio de unión exón-intrón, provocando un apareamiento con los primeros seis nucleótidos del intrón, delimitando así el exón 1;
2. La unión del factor U2AF (que tiene el dominio SR) con el sitio Py;
3. La participación en el complejo de los factores SC35, SF2/ASF, SF1/BBP y el U2snRNP.

Figura 2. Biología Molecular del splicing. El splicing ocurre de manera secuencial en varios pasos en el spliceosoma (complejos E-->A-->B1-->B2-->C1-->C2). Los factores no snRNPs (U2AF65/35, verde), proteínas SR, (amarillo) - ambas con el dominio RS- y los factores snRNP (naranja), participan en el reconocimiento y acercamiento de los sitios de unión intrón-exón, para que ocurran los dos pasos de transesterificación.

Posteriormente, el complejo E se transforma en el complejo A, cuando el U2snRNP se une al sitio de empalme. El complejo B1 se forma luego, cuando se asocia el trímero U4/U5/U6snRNP pre-ensamblado. Así, el U5snRNA se une al sitio de splicing 5’ y el U6snRNA se une al U2snRNA. Este complejo forma un spliceosoma maduro. Más tarde, se forma el complejo B2, en donde se libera el U1snRNA, el U5snRNA se mueve del exón hacia el intrón y el U6snRNA se une al sitio de splicing 5`. Este paso se lleva a cabo mediante un apareamiento de aproximadamente 20 bases entre el U1snRNA y el U4snRNA. Como consecuencia, se activa el spliceosoma para llevar a cabo su catálisis. La función de U5snRNA es interactuar con secuencias del exón, en el sitio del procesamiento 5´y 3´. El complejo C1 se forma cuando se libera el U4snRNA y el U5snRNA se une al exón en el sitio de splicing 3’. En este punto se cataliza la transesterificación, es decir, se rompe el sitio de splicing 5’ y se forma el lariat. Finalmente se forma el complejo C2, que contiene el trímero U2/U5/U6snRNAs, el cual permite el rompimiento del sitio de splicing 3’ y se ligan los exones (15). A pesar de los mecanismos descritos, la selección de los sitios de splicing, no están libres de error. Estas secuencias reguladoras del sitio de splicing y el spliceosoma, son incapaces de distinguir entre dos o más apareamientos alternativos de los sitios de splicing 5’ y 3’. Sin embargo, asisten el proceso de reconocimiento por unión a las proteínas regulatorias (16).

En un típico mRNA multiexón, el modelo de splicing alternativo puede ser alterado por muchas rutas, como lo muestra la figura 3. La mayoría de los exones son constitutivos, lo que quiere decir que ellos son siempre incluidos en el mRNA final. Un exón regulado, el cual algunas veces es incluido y otras excluido del mRNA, es llamado un exón casete. De esta forma, un exón mutuamente exclusivo ocurre cuando dos o más exones casete adyacentes son cortados y empalmados, incluyéndose sólo uno por vez. Los exones también pueden ser alargados o acortados por alteración en la posición de uno de sus sitios de splicing.

 Figura 3. Modelos de splicing alternativos: Secuencias constitutivas presentes en todos los mRNAs finales se muestran en cajas grises. Segmentos alternativos de RNA pueden o no ser incluídos en el mRNA y estos se observan marcados con diferentes trazos. (A) Un casete exón puede ser incluído o excluído en el mRNA. (B) Exones mutuamente excluyentes ocurren cuando dos o más casete de exones adyacentes son empalmandos, por lo que solo un exón es incluido a la vez. (C, D) Sitios de splicing alternativos 5’ y 3’ determinan un exón más largo o un exón más corto. (E, F) Promotores alternativos y sitios de poli (A) cambian el 5’ o el 3’ de muchos transcritos. (G) Un intrón retenido puede ser escindido desde el pre-mRNA o puede retenerse en el mRNA que será traducido. (H) Un pre-mRNA puede exhibir múltiples sitios de splicing alternativos usando diferentes modelos de inclusión.

Alteraciones en promotores y sitios poli(A) alternativos cambian el sitio 3’ o 5’ de muchos exones.

Finalmente, algunos eventos son controlados por la falla en la remoción de un intrón, un modelos de splicing llamado “retención de intrón”. Un pre-mRNA puede exhibir múltiples sitios de splicing alternativo, usando diferentes modelos de inclusión, generando de esta forma, diferentes mRNAs. Cambios en la elección del sitio de empalme puede generar efectos en la proteína que será sintetizada. Pequeños cambios en la secuencia polipeptídica pueden alterar la unión de ligandos, actividad enzimática,  regulación alostérica o localización de la proteína.

El hallazgo de TRPM3 en humanos y sus respectivas variantes

Durante el año 2003, Lee y colaboradores, encontraron un nuevo miembro de la familia TRP en humanos, el que fue llamado hTRPM3. Esta proteína está formada por un total de 1555 aminoácidos y posee las siguiente formas típicas de un canal TRP: seis dominios transmembrana, un dominio formador del poro, ubicado entre los aminoácidos 748-959, un motivo, conocido como la dominio TRP compuesto por la secuencia XWKFXR localizada río abajo del sexto segmento transmembrana y un domino coiled coil ubicado en el carboxilo terminal, río abajo de la dominio TRP. Un análisis de la secuencia genómica de hTRPM3, muestra que la región codificante alcanza 311 kb y comprende 24 exones separados por una de las secuencias intrónicas más largas del cromosoma 9. El gen de esta proteína se encuentra ubicado en el cromosoma 9q21.12 mientras que en ratas se localiza en el cromosoma 1q15 y en ratón en el 19. hTRPM3 es muy similar a hTRPM1 con un 57% de identidad y un 67% de similitud, además, se observó una fuerte homología (sobre el 80%) en el N-terminal, entre los aminoácidos 1 y 1219.

hTRPM3 fue originalmente detectado por medio de análisis de bioinformática, utilizando programas como, CLUSTALW, con el cual se realizaron alineamientos múltiples de secuencias correspondientes a los miembros de las familias de TRP conocidos, analizando la homología entre ellas y detectando los sitios más conservados, los cuales fueron utilizados para diseñar los partidores y así poder, más tarde, amplificar fragmentos a partir de una librería de cDNA de riñón humano. Los fragmentos resultantes, fueron ensamblados para generar el cDNA de largo total. Posteriores análisis de RT-PCR y Northern blot, determinaron la presencia de hTRPM3 en numerosos tejidos como cerebro, testículos, y de manera muy abundante, en riñón, sin embargo, parece estar ausente en una gran variedad de otros tejidos humanos. Esta última estrategia, se realizó, por medio de sondas específicas contra hTRPM3 de 645 pb.

Además, en el mismo estudio, se identificaron seis variantes desde una librería de cDNAs de riñón humano, usando partidores diseñados desde la secuencia codificante del gen hTRPM3.

Estas fueron designadas como hTRPM3 a-f. Sus largos van desde 1544 a 1579 aminoácidos (figura 4) (1,17), motivo por el cual no fue viable detectar estas variantes por el método de northern blot. Por otra parte, sólo se pudieron obtener datos funcionales de hTRPM3a, la cual, excepcionalmente permite la entrada preferencial de cationes monovalentes, y de hTRPM3b, cuya expresión heteróloga, exhibe la entrada de calcio y magnesio dependiente de la concentración, siendo por lo tanto, un canal selectivo a cationes divalentes, el cual además es bloqueado por cationes monovalentes, de manera similar a la forma canónica.

La variante de splicing hTRPM3a presenta la exclusión del exón 7 y 11, lo que genera una deleción del N terminal citoplasmático. Luego, la variante hTRPM3b además de presentar una exclusión del exón 7 y una deleción entre el exón 11 y 12, muestra una inserción de 12 aminoácidos entre el exón 13 y el 15, lo que genera una deleción y una posterior inserción en el N citoplasmático. hTRPM3d, presenta la exclusión del exón 7, 11y 13 y presenta una deleción entre el exón 14 y15, esto provoca deleciones en el N-terminal citoplasmático, tampoco presenta datos funcionales. Por su parte, la variante hTRPM3e, presenta la exclusión del exón 7 y 13, además de una inserción de 12

aminoácidos entre el exón 14 y 15 y una deleción entre los exones 11 y 12, esto también genera deleciones e inserciones en el N-terminal citoplasmático (sin datos funcionales). La variante hTRPM3c presenta una exclusión del exón 7 y del exón 11, además de una inserción de 12 aminoácidos en el exón 20 lo que genera una deleción del amino terminal citoplasmático y por otro lado, variaciones en la región del poro del canal. El gen hTRPM3f incluye el exón 4, ausente en todas las demás variantes y además presenta 18 aminoácidos codificados por el exón 8. Por último, se encuentra la isoforma 10, la cual sólo es encontrada en cerebro y riñón de humanos fetales (2). Esta variante presenta la exclusión del exón 7 y además la incorporación de 6 aminoácidos en el último exón, lo que genera un canal de Ca²⁺ que modula su entrada por una alteración en la osmolaridad extracelular.

Figura 4: Variantes de splicing de hTRPM3. Se detectaron cinco variantes adicionales: b-f y KIAA1616. Algunas de las  diferencias en las variantes b-f son mostradas en un cuadro. Los exones codificantes son mostradas por  números que van desde el 1 al 24. Como se muestra en la figura, el gen hTRPM3b  contiene un exón extra, el exón 11. el gen hTRPM3c contiene un exón, que corresponde al 20, el cual produce la adición de 12 aminoácidos a la proteína . El gen hTRPM3d el exón 13 es excluido, mientras que en el gen hTRPM3e incluye el exón 11. Finalmente, el gen hTRPM3f incluye el exón 4 y 18 aminoacídos codificados por el exón 8.

Por su parte Grimm y colaboradores (2), usando la estrategia de PCR 5’ y 3’ RACE, identificaron 3 fragmentos de cDNA desde cerebro fetal y riñón, a partir de lo cual predijeron una proteína de 1325 aminoácidos, que presenta un carboxilo terminal considerablemente más corto que el presente en la forma canónica, sin embargo, tiene un amino terminal de 153 aminoácidos adicionales, el cual no forma parte de ninguna otra variante de TRPM3. Posteriores análisis de electrofisiología revelaron que esta proteína correspondía a un canal catiónico no selectivo, permeable a Ca²⁺ y sensible a la osmolaridad del medio extracelular y la llamaron TRPM3₁₃₂₅. La actividad de los canales TRPM3₁₃₂₅ es reportada por aumentar el volumen celular en soluciones hiposmóticas.

La información disponible de los transcritos revela que muchas diferentes especies de mRNA codifican para una gran variedad de proteínas TRPM3. La variabilidad de estos transcritos depende de dos o probablemente de tres posiciones de inicio y de dos diferentes sitios de término. La diferencia en el término del C-terminal depende de un sitio de splicing altamente conservado que se encuentra en las variantes largas en el aminoácido 1318. En mRNAs que codifican para variantes de alto peso molecular, la maquinaria de splicing ignora este sitio, mientras que en especies de mRNA que codifican para variantes de menor peso molecular, el resultado del reconocimiento de este sitio es la adición de un exón accesorio que codifica sólo para 8 aminoácidos.

La actividad constitutiva de TRPM3 de ratón, también fue caracterizada por Oberwinkler (4). Ellos describen TRPM3 como un canal proteico de 1725 aminoácidos, formado por 28 exones y que alcanza 850 kb. Este canal es permeable a calcio y magnesio. Adicionalmente, ellos analizan una gran variedad de variantes de splicing generadas en cerebro de ratón, las que además, confirman las variantes encontradas por Lee (18). Este grupo, es responsable de caracterizar una variante con 10 aminoácidos adicionales en el asa extracelular siguiente al putativo segmento transmembrana número 6. La presencia de los aminoácidos adicionales resulta en una pérdida de permeabilidad iónica. De esta manera, cuando la variante y la silvestre se expresan juntas, la permeabilidad es disminuida, lo que llevaría a pensar que esta variante de poro de TRPM3 presenta un carácter dominante negativo. Análisis detallados en un futuro, podrían mostrar si TRPM3 poro-variante es traducida sola o junto con otras variantes de TRPM3 en célula única. La traducción de TRPM3 poro-variante junto a otras variantes de TRPM3 pueden ayudar a la célula a modular su permeabilidad iónica celular a nivel traduccional.

Las variantes identificadas por Oberwinkler, fueron designadas como TRPM3a1, TRPM3a2, TRPM3a3, TRPM3a4 y TRPM3a5. Su secuencia aminoacídica comprende desde 1699 a 1721 aminoácidos, los cuales son codificados por los exones 1, 3-7 y 9-28. Los exones 2 y 8 no están presentes en el cDNA de variantes de TRPM3 de ratón, pero 18 aminoácidos codificados por el exón 8 han sido detectados recientemente en variantes como el hTRPM3f (18). El exón 2 codifica una secuencia de 59 aminoácidos que corresponde a la parte amino terminal de la variante TRPM3₁₃₂₅ en humanos (2) pero está ausente en las variantes a - f de hTRPM3. El exón 1 codifica para una secuencia amino terminal completamente nueva que no está presente en alguna de las variantes de TRPM3 humanos descritos.

Se ha visto que las proteínas TRPM3 de ratón muestran aproximadamente un 97% de identidad en su secuencia aminoácidica con las variantes humanas. Así el TRPM3a1 de ratón corresponde a la humana TRPM3c, mTRPM3a2 a hTRPM3a, mTRPM3a3 a hTRPM3b, mTRPM3a4 a hTRPM3e y mTRPMa5 a hTRPM3d. TRPM3a1 y TRPM3a2, difieren solo en una región entre el quinto y el sexto segmento transmembrana, donde se reporta la región formadora del poro del canal. Esta región es 12 aminoácidos más largo en TRPM3a1 comparado con TRPM3a2, adicionalmente, una prolina es sustituida por una alanina, por lo tanto, presentaría una mutación puntual en el exón 20. Estos datos, muestra que TRPM3 está sujeto a frecuente splicing alternativo, implicando que diferencias funcionales descritas pueden ser causadas por las diferentes estructuras primarias de las variantes. Además, la fuerte correspondencia entre los respectivos transcritos indica que no sólo las secuencia aminoacídicas si no también los eventos de splicing, son altamente conservados entre ratón y humano. Así, la fuerte conservación generalmente sugiere la importancia de las proteínas, como

en este caso de TRPM3, pero también muestra la importancia de su regulación y modificación por splicing alternativo.

Variantes de TRPM3 como reguladores osmóticos

Aún no se tiene claro, cuales son los factores que favorecen la presencia de una u otra variante del canal, sin embargo, es probable que esto se genere a modo de una regulación celular frente a ciertos cambios, como es el caso de una variación en el gradiente osmótico (19).

Diferencias en el gradiente de concentración iónico son responsables de la hinchazón o del encogimiento de la célula por incremento o disminución del agua intracelular, respectivamente (20). La viabilidad de las células depende de mecanismos que aseguren una rápida adaptación a la tonicidad extracelular. Por modulación de canales iónicos y transportadores, las células modulan su concentración iónica intracelular para adaptarse a las condiciones ambientales y para facilitar su función celular (3,21).

TRPM3 y sus variantes de splicing son proteínas que se encuentran específicamente a nivel de células epiteliales del túbulo colector, en el riñón. Estas, han sido caracterizadas, como proteínas que median la entrada de calcio en las células en soluciones extracelulares hiposmóticas (2,21). Se ha visto, que al menos dos variantes de este canal pueden ser expresados desde este

gen presentando selectividades iónicas completamente diferentes. El canal hTRPM3a, preferencialmente conduce la entrada de cationes monovalentes, mientras que hTRPM3b fuertemente favorece la entrada de cationes divalentes. Previamente, la variante humana TRPM3₁₃₂₅ ha sido reportada por mediar el incremento en la entrada de calcio cuando la osmolaridad de la solución extracelular cambia desde 300 a 200 mosmol/kg, un estímulo que induce un considerable aumento de volumen de las células. In vivo, cada uno de los cambios en la selectividad iónica puede tener considerables consecuencias para la función del canal y la fisiología de las células que lo expresan.

Minigenes, una ventana al conocimiento de la regulación de splicing para TRPM3

Considerando la escasa información existente sobre la regulación del splicing alternativo del canal TRPM3 y dada la importancia que se les ha otorgado en el proceso de osmoregulación, es necesario conocer a cabalidad la regulación de este mecanismo y para esto, se pueden abordar preguntas básicas tales como, ¿cuáles son los elementos exónicos e intrónicos que favorecen o reprimen el splicing?, ¿cuáles exones son constitutivos y cuáles son alternativos?, el tamaño de los exones ¿es importante para preferir su inclusión?, ¿existe algún tipo de splicing alternativo, más favorecido que otros en estas célula epiteliales? y si es así, ¿qué elementos regulatorios, cis y trans, son necesarios para que esto ocurra?, entre muchas otras.

Para resolver alguno de estos problemas, es posible aplicar el uso de minigenes. Como su nombre lo indica, un minigen, es una versión simplificada y artificial de un gen (22), cuyo uso, nos permitirá:

(1)    determinar el rol de los sitios de splicing 3’ y 5’, en el reconocimiento de un exón;

(2)    identificar elementos exónicos e intrónicos, capaces de aumentar o reprimir el splicing,

(3)    determinar si una variante alélica tiene algún efecto en la eficiencia del splicing,

(4)    identificar elementos requeridos para la regulación específica de una determinada célula.

(5)    identificar elementos requeridos para la regulación por factores activadores trans específicos (23).

Como se observa en la figura 5, los minigenes, contienen un segmento genómico proveniente de un gen de interés que incluye una o varias regiones de splicing alternativo y regiones genómicas flanqueantes. El segmento genómico es generado por amplificación por PCR ya sea, usando como templado directamente el DNA genómico o un fragmento de DNA genómico clonado.

Figura 5. Minigene vector. CMV, promotor y enhancer transcripcional para una expresión ubicua a nivel celular, además se muestran ambos sitios de restricción (RS#1 y #2), el segmento genómico clonado y ubicación de los elementos cis.

Además, es muy importante generar sitios para enzimas de restricción que permitan el posterior clonamiento del fragmento, en el  plasmidio. El largo de las secuencias genómicas flanqueantes, dependerá de nuestro objetivo en el análisis y se puede  encontrar en un rango desde decenas a cientos de nucleótidos. Para determinar si una variante alélica es responsable de alterar el splicing, o para probar si un motivo  específico en la secuencia es el elemento responsable para un putativo factor regulatorio, el minigen podrá incluir los elementos cis de interés. Para identificar elementos cis activadores requeridos para la regulación celular-específica de un exón alternativo, se podrá cambiar aquel fragmento que probablemente contenga elementos regulatorios primarios. Basados en el conocimiento actual, los elementos regulatorios primarios se encuentran típicamente entre 200 - 300 nucleótidos río arriba y/ o río abajo de un exón regulado. Por otro lado, cuando un segmento genómico ha sido mostrado por contener elementos que son suficientes para regular el splicing, acortamientos de estas secuencias desde los sitios desde sus sitios 3’ o 5’, podrían ser usados para definir pequeños fragmentos genómicos necesarios y suficientes para su regulación. Esta estrategia, servirá para determinar el segmento genómico mínimo que facilita la identificación de un elemento cis importantes, gracias a la eliminación funcional de los mismos. Por otro lado, si esto fallara, sería recomendable utilizar segmentos genómicos largos, para demostrar regulación. Por ejemplo, un fragmento genómico que abarca desde un exón río arriba del exón alternativo a un exón río abajo del siguiente exón alternativo, es muy probable que incluya todos los elementos regulatorios relevantes y necesarios para su regulación.

            De esta forma, el sistema de minigenes es una importante herramienta para la identificación y análisis in vivo de reguladores como elementos cis y factores trans, que establecen un splicing alternativo eficiente y regulado, además, la expresión de preRNAs mediante el sistema minigene, por transfección transciente, provee un rápido ensayo para conocer la pérdida de función y/o el análisis de la pérdida o ganancia de elementos cis y/o factores trans que afectan la regulación de la transcripción. Por lo tanto, el uso de minigenes, nos darán algunas luces sobre el mecanismo de regulación del splicing de estos canales y sobre el modo de regulación específicamente en células epiteliales.

Conclusiones

            Recursos obtenidos desde base de datos genómicos ofrecen mayor facilidad a la identificación de muchos de los genes de TRP en los últimos 10 años por revisiones similares a las descritas. Sin embargo, ya que la regulación transcripcional y el procesamiento post transcripcional del mRNA son escasamente predecibles y muy complejos, se hace cada vez más necesario descifrar el transcriptoma del TRP. Los diferentes largos de los mRNAs de TRPM3 y las diferencias en la masa molecular de las proteínas, resultan de diferentes mecanismos de regulación de splicing.

            Ciertamente, la información en el presente, acerca de cuáles son las posibles mecanismo de regulación del splicing para este canal, así como las implicancias funcionales que tengan cada variante a nivel celular y fisiológico, son muy escasas, sin embargo, estos antecedentes dan luces de la importancia del canal y sus variantes, siendo necesario estudiar en detalle los mecanismos que imperan en el procesamiento del RNA, estableciendo por ejemplo, en qué situaciones se activa una u otra variante, o determinar si se coexpresan in vivo con la proteína canónica, generando un efecto dominante negativo, como es el caso de la variante 1325.

            Sin duda, aún queda mucho por investigar, sin embargo, es un camino obligado, para conocer en detalle el mecanismo de regulación del volumen de la célula a nivel molecular.

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Para una forma más interactiva de entender el mecanismo de splicing, puedes observar el siguiente vídeo.