Para llevar a cabo esta técnica es necesario lograr primero la configuración cell attached. Una vez conseguido el gigasello (resistencia del orden del giga ohm), es necesario romper la membrana que está por debajo del orificio de la pipeta provocando con esto, el contacto eléctrico directo con el citoplasma, de tal modo, que la solución de registro ubicada en el interior de la pipeta queda en contacto con el medio interno de la célula. Un método común para romper la membrana es aplicarle una pequeña succión al parche.
Una pipeta de patch es lo suficientemente grande como para permitir el lavado del citoplasma por la solución de registro.Ya que el volumen de una célula es pequeño comparado con la pipeta de parche, la composición del fluido intracelular puede ser considerado igual al de la solución de registro que llena la pipeta. Si lo que se desea es emular una situación fisiológica, entonces la pipeta deberá ser llenada con una solución de composición iónica que se acerque lo más posible a la composición interna de la célula.
Es necesario considerar que la manipulación del medio interno de la célula puede ser tan bueno como malo, dependiendo por supuesto, de lo que se desee obtener, ya que es probable que en algunos casos, factores citosólicos importantes para el funcionamiento del canal, puedan ser removidos o "diluidos" a tal punto que afecten el comportamiento de nuestra proteína de estudio. Para evitar este problema, en muchos casos es posible aplicar parche perforado, donde el contacto eléctrico con el citosol es establecido por la adición a la pipeta de agentes perforadores de membrana. Agentes perforadores como la nistatina o la amfotericina B perforan la membrana, por lo que solamente moléculas pequeñas como los iones pueden pasar a través de los agujeros producidos, manteniendo de este modo la composición citoplasmática intacta, en cuanto a su composición orgánica.
Figura 1: Registro en condiciones de whole cell. Como se ve en el esquema, para llegar a la configuración de célula completa, es necesario primero pasar por cell attached. Una vez perforada la membrana tras una suave succión, todos los canales de la célula podrán ser analizados bajo esta condición. Por lo tanto, nunca podremos registrar canal único pero sí obtendremos corrientes macroscópicas.
Imagen obtenida desde
http://butler.cc.tut.fi/~malmivuo/bem/bembook/
No hay comentarios:
Publicar un comentario